陆军军医大学罗强团队新型纳米机器人，精准阻断PD-L1 + 原位纤维化破坏癌细胞膜，双重激活免疫杀伤。

研究背景

结直肠癌（尤其是pMMR型“冷”肿瘤）对PD-1/PD-L1阻断疗法响应极差，超95%患者无效，主要因肿瘤微环境高度免疫抑制，T细胞难以浸润。传统联合化疗、放疗或光热疗法虽可通过诱导免疫原性细胞死亡（ICD）释放DAMPs，将“冷”瘤转为“热”瘤，但副作用严重（如骨髓抑制、腹泻、免疫相关不良事件）。因此，亟需开发低毒、高特异性的策略：分子靶向精准释放DAMPs + PD-1/PD-L1阻断，成为pMMR型结直肠癌免疫治疗的新方向。

研究内容

本研究设计了一种智能肽-接枝聚合物纳米机器人（NRb），在生理pH下为纳米颗粒，到达肿瘤酸性微环境（pH 6.5）后靶向PD-L1并原位纤维化，形成纤维网络，实现两大功能：① 持久阻断PD-1/PD-L1（肿瘤滞留>120 h），恢复T细胞杀伤；② 机械破坏癌细胞膜，精准诱导ICD，释放DAMPs，促进CD4+/CD8+ T细胞大量浸润。在多种结直肠癌小鼠模型中，疗效显著优于αPD-L1+奥沙利铂联合方案，且靶向性强、生物相容性好，为pMMR型结直肠癌免疫治疗提供临床潜力。

研究结果

Fig. 1：NRb锚定肿瘤细胞并转化，实现PD-1/PD-L1阻断与DAMPs释放。

a, NRb的制备示意图，包括肽P（PD-L1靶向序列）、K（pH响应转化单元）和CS单元。NRb在pH 6.5条件下从纳米颗粒（NPs）转化为纳米纤维（NFs）。b, NRb通过结合PD-L1实现肿瘤靶向富集，并在pH 6.5下原位转化，随后（i）实现长期PD-1/PD-L1阻断，恢复T细胞杀伤活性；（ii）通过破坏癌细胞膜释放肿瘤抗原，促进T细胞向肿瘤浸润，从而增强免疫治疗效果。

Fig. 2：NRb的制备及pH诱导转化过程。

a, 丙烯酰化壳聚糖（acryl-CS）和NRb的合成路线。NRb通过丙烯酰-CS中的烯烃键与K和P中过量的巯基发生Michael加成反应合成，K:P的摩尔比为1:1。对照组C-NRb采用相同方法，由丙烯酰-CS与K′和P′反应制备。b, CS、acryl-CS、NRb和C-NRb在D₂O中的¹H核磁共振谱图。c, 酸性环境下组氨酸质子化诱导NRb纳米颗粒（NPs）转化为纳米纤维（NFs）的示意图。d, NRb（1.0 mg ml⁻¹）和C-NRb（1.0 mg ml⁻¹）分别在pH 6.5和pH 7.4条件下孵育24 h后的透射电子显微镜（TEM）图像。n = 3个独立样品。e,f, NRb（e）和C-NRb（f）在pH 6.5和pH 7.4条件下培养24 h后的粒径分布。g,h, NRb（g）和C-NRb（h）在pH 6.5和pH 7.4条件下0 h和24 h的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。i, Cy5标记的NRb和C-NRb与ThT（20 μM，绿色）在pH 6.5条件下孵育24 h后的体视激光共聚焦显微镜（CLSM）图像。比例尺，5 μm。n = 3个独立样品。j, CT26细胞在pH 6.5或pH 7.4条件下与NRb或C-NRb共孵育4 h的示意图及CLSM图像。比例尺，10 μm。n = 3个独立样品。k, CT26细胞分别在pH 6.5或pH 7.4条件下与NRb或C-NRb孵育后的扫描电子显微镜（SEM）图像（n = 3个生物学独立样品）。比例尺，10 μm，1 μm（放大图像）。红色通道：λex = 647 nm，λem = 649–693 nm；绿色通道：λex = 488 nm，λem = 500–550 nm；蓝色通道：λex = 405 nm，λem = 415–465 nm。

Fig. 3：NRb通过原位纤维化行为破坏细胞膜，释放DAMPs。

a：CT26细胞先与0.2 μM钙黄绿素（绿色）共孵育0.5 h，再在pH 6.5或pH 7.4条件下用NRb或C-NRb处理24 h后的CLSM图像。比例尺，7.5 µm。n = 3个独立样品。b：同a处理方式，并在处理后用Dil染细胞膜、DAPI染核的CT26细胞CLSM图像。比例尺，10 µm。n = 3个独立样品。c：CT26细胞在PBS、NRb或C-NRb处理（pH 6.5和pH 7.4）后培养基中LDH泄漏量。数据为均值±标准差，n = 3个生物学独立样品。统计采用单因素方差分析+事后Tukey检验。d：CT26细胞与NRb NPs孵育4 h和24 h，以及与NRb NFs孵育24 h（pH 6.5）后的原子力显微镜测得的高度、硬度和杨氏模量图像。比例尺，2 µm。n = 3个独立样品。e：d中CT26细胞杨氏模量的定量统计。数据为均值±标准差，每组n = 12（4 h组n = 11），n = 3个独立样品。统计采用Welch’s ANOVA检验。f：d中CT26细胞的悬臂力-压入距离曲线（以力开始增加为起点）。g：不同浓度NRb（左）和C-NRb（右）在pH 6.5和pH 7.4条件下处理CT26细胞的细胞存活率。数据为均值±标准差，n = 3个独立实验。统计采用单因素方差分析+事后Tukey检验。h,i：pH 6.5条件下NRb处理CT26细胞后HMGB1（h）和CRT（i）的免疫荧光图像。比例尺，50 µm。n = 3个独立样品。j：CT26细胞在PBS（i）、NRb pH 6.5（ii）、NRb pH 7.4（iii）、C-NRb pH 6.5（iv）和C-NRb pH 7.4（v）处理后培养基中释放的ATP量。数据为均值±标准差，n = 3个生物学独立样品。统计采用单因素方差分析+事后Tukey检验。k：体外研究NRb在pH 6.5下释放DAMPs激活T细胞的Transwell模型示意图。l：DC成熟（CD80+CD86+，门控于CD11c+细胞）的代表性流式图及定量分析。数据为均值±标准差，n = 3个生物学独立样品。统计采用单因素方差分析。m：Transwell系统孵育后小鼠脾脏CD3+ T细胞的流式分析图像及定量统计。数据为均值±标准差，n = 3个生物学独立样品。统计采用Kruskal–Wallis检验。n：小鼠脾脏CD8+ T细胞（门控于CD3+细胞）的代表性结果及定量分析（(i) PBS；(ii) NRb pH 6.5；(iii) NRb pH 7.4；(iv) C-NRb pH 6.5；(v) C-NRb pH 7.4）。数据为均值±标准差，n = 3个独立实验。P值采用单因素方差分析+事后Tukey检验。红色通道：λex = 555 nm，λem = 570–620 nm；绿色通道：λex = 488 nm，λem = 500–550 nm；蓝色通道：λex = 405 nm，λem = 415–465 nm。

Fig. 5：NRb在MC38异种移植C57BL/6小鼠或CT26肺转移BALB/C小鼠模型中的抗癌效果。

a：MC38荷瘤小鼠模型建立、不同给药方案处理（PBS (i)、NRb+Oxa (ii)、NRb (iii)、C-NRb+Oxa (iv)、C-NRb (v)、αPD-L1+Oxa (vi)、αPD-L1 (vii)、Oxa (viii)）及三周观察示意图。b：不同处理组小鼠体重变化。数据为均值±标准差，n = 4只小鼠（C-NRb ± Oxa组及αPD-L1+Oxa组n = 5）。c：不同处理组小鼠肿瘤体积变化。数据为均值±标准差，n = 4只小鼠（C-NRb ± Oxa组及αPD-L1+Oxa组n = 5；PBS、Oxa组n = 3）。统计采用Kruskal–Wallis检验。d：体内评价后各组小鼠离体肿瘤重量。数据为均值±标准差，n = 3只小鼠/组。P值采用单因素方差分析+事后Tukey检验。e：体内评价后各组离体肿瘤代表性图像（n = 3只小鼠/组）。f：不同处理后肿瘤组织中CD8+（绿色）和CD4+（红色）T细胞的代表性免疫荧光图像。比例尺，25 μm。n = 3个独立样品。g,h：肿瘤免疫细胞中CD8+ T细胞（g）和CD4+ T细胞（h）的流式分析（PBS、NRb、C-NRb、αPD-L1处理组）。i,j：肿瘤组织中CD8+（i）和CD4+（j）T细胞百分比（PBS (i)、NRb (ii)、αPD-L1 (iii)、C-NRb (iv)组）。数据为均值±标准差，n = 3个生物学独立样品。统计采用单因素方差分析+事后Tukey检验。k：CT26荷瘤小鼠模型建立、不同给药方案处理及三周观察示意图。l–n：各组小鼠体重（l）、代表性肺组织图像及其苏木精-伊红染色（m）以及肺组织肿瘤转移灶平均数量（n）。比例尺，2 mm。n = 4只小鼠（αPD-L1、αPD-L1+FOLFOX、FOLFOX组n = 3），l和n数据为均值±标准差。统计采用单因素方差分析+事后Tukey检验。红色通道：λex = 555 nm，λem = 570–620 nm；绿色通道：λex = 488 nm，λem = 500–550 nm；蓝色通道：λex = 405 nm，λem = 415–465 nm。Wt，野生型。

Fig. 6：NRb在AOM/DSS诱导的原发肿瘤模型中的抗肿瘤活性。

a：AOM/DSS诱导建立结肠炎相关结直肠癌（CAC）模型过程及抗肿瘤治疗示意图；建模70天后，小鼠随机分为8组：PBS (i)、NRb+Oxa (ii)、NRb (iii)、C-NRb+Oxa (iv)、C-NRb (v)、αPD-L1+Oxa (vi)、αPD-L1 (vii)、Oxa (viii)。b：各组小鼠建模期间体重变化趋势。数据为均值±标准差，n = 6只小鼠/组。c–g：各组小鼠体重维持（以第一天体重归一化，c）、每只小鼠肿瘤体积径向柱状图（d）、平均肿瘤体积（e）、平均肿瘤数量（f）以及不同大小肿瘤分布（0–2、2–4、4–6、>6 mm³；g）。n分别为PBS、NRb+Oxa、NRb、C-NRb+Oxa、C-NRb、αPD-L1+Oxa、αPD-L1、Oxa组的3、6、6、3、4、4、5、4只，c、e、f数据为均值±标准差。统计采用单因素方差分析。h：肿瘤切片中CD8+ T细胞免疫荧光染色（n = 3个生物学独立样品）。比例尺，75 μm。i：治疗后肿瘤组织IFN-γ（棕色）的免疫组化分析（n = 3个生物学独立样品）。比例尺，40 μm。j：接受PBS、NRb、αPD-L1或C-NRb注射后肿瘤组织HMGB1（红色）和CRT（绿色）的免疫荧光染色（n = 3个生物学独立实验）。比例尺，50 μm。k：PBS、NRb、αPD-L1及C-NRb处理小鼠肿瘤的生物透射电镜图像，显示NRb组细胞膜破裂（n = 3个生物学独立样品）。比例尺，2 μm。红色通道：λex = 555 nm，λem = 570–620 nm；绿色通道：λex = 488 nm，λem = 500–550 nm；蓝色通道：λex = 405 nm，λem = 415–465 nm。

结论

NRb是一种肿瘤微环境pH触发的“可转化”纳米机器人，在癌细胞表面原位纤维化，机械破坏细胞膜精准诱导ICD并释放DAMPs，同时持久阻断PD-1/PD-L1，显著改善pMMR型结直肠癌的免疫逃逸和T细胞浸润不足问题。单药疗效优于商业αPD-L1，且比传统放化疗+免疫联合方案滞留更久、靶向更强、副作用更少。

小鼠模型中安全有效，但临床转化仍需验证人体抗瘤机制、长期生物降解及更高物种安全性。NRb单药策略为免疫耐药pMMR结直肠癌提供高潜力纳米免疫新路径。

来源：纳米生物前沿

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41565-025-02071-3