呼吸道合胞病毒（RSV）是导致婴幼儿和老年人严重下呼吸道感染的主要病原体之一，2015年全球估计导致约5.96万名儿童和11.82万名成人死亡，疾病负担极为沉重。经过半个多世纪的疫苗研发探索，早期全灭活RSV疫苗曾引发疫苗相关疾病增强效应，促使研究者将方向转向亚单位疫苗。其中，融合糖蛋白（F蛋白）作为病毒入侵的关键介导分子，成为核心靶标。F蛋白存在融合前构象（pre-F）和融合后构象（post-F），其中pre-F构象包含关键的中和敏感表位，但其构象不稳定性一直是疫苗研发的瓶颈。近年来，通过结构指导的定点突变稳定pre-F构象，已有多种pre-F亚单位疫苗（包括蛋白亚单位和mRNA疫苗）经肌肉注射途径获批上市。然而，由于RSV主要通过呼吸道黏膜感染，现有的肌肉注射疫苗难以有效诱导呼吸道局部的黏膜免疫应答，这凸显了开发鼻喷疫苗以建立第一道免疫防线的迫切需求。
近日，国家纳米科学中心聂广军研究员、程科满副研究员、赵潇研究员合作，构建了一个具有可控几何尺寸的DNA纳米载体库，系统评估了几何特性对鼻内滞留能力的影响；并利用DNA纳米载体的精准可编程性，在载体表面以优化的空间排布模式组织RSV pre-F单体抗原，以最大化B细胞激活效果。经优化的DNA纳米载体疫苗在小鼠体内诱导的体液免疫应答水平与临床获批的RSV mRNA三聚体疫苗相当，且具有更持久的免疫效果。更重要的是，肌肉注射的mRNA疫苗无法有效诱导呼吸道黏膜免疫，而鼻喷DNA纳米疫苗则能在呼吸道局部及全身建立强效的免疫激活，为小鼠提供强有力的抗RSV感染保护。相关内容以“Intranasal DNA nanocarrier vaccines with surface-patterned antigens enhance efficacy against respiratory syncytial virus”为题发表在《Nature Materials》上。
研究团队首先构建了不同维度的荧光标记DNA纳米载体（一维线形、二维三角形和三维八面体），探究几何维度对呼吸道滞留的影响（图1a）。结果表明，经鼻给药后，载体在呼吸道的滞留量随维度从一维到三维显著增加，三维纳米载体在鼻腔和肺部的滞留效果最为突出（图1b、c）。在此基础上，团队进一步合成了三种不同尺寸的三维DNA纳米载体——28纳米八面体、43纳米二十面体和90纳米二十面体（图1d）。实验显示，90纳米二十面体（ICO）在鼻腔和肺部具有最高的滞留荧光强度，提示其降解和清除速度最慢。研究还发现，无论经鼻还是经气管给药，所有DNA纳米载体均主要局限在呼吸道内，在其他主要器官未检测到荧光信号，表明其具有良好的生物安全性。基于上述结果，团队选定具有最优滞留特性的90纳米二十面体DNA纳米载体（ICO）进行后续实验。
图1 | 不同几何性质的DNA纳米载体经鼻给药后的生物分布。
为实现RSV pre-F单体抗原在ICO表面的精准修饰，研究团队采用了“刻印-印刷”策略，分三步完成：DNA纳米载体组装、位点刻印和抗原印刷（图2a）。在组装步骤中，以M13mp18噬菌体基因组DNA为骨架，与多条订书钉链退火形成ICO结构（图2b），并在特定位点替换为延伸的捕获链。在刻印步骤中，将含叠氮基团的SpyTag肽通过点击化学与DBCO修饰的适配链偶联（图2c、d），随后通过碱基互补配对将SpyTag-适配体偶联物“刻印”到ICO表面的特定位点，形成ICO-SpyTag（图2e）。最后，在抗原印刷步骤中，将融合SpyCatcher的RSV pre-F单体蛋白通过SpyTag/SpyCatcher共价键精准“印刷”到ICO表面，形成ICO-RSV疫苗。动态光散射显示ICO和ICO-RSV的平均水合粒径分别为93.66纳米和115.81纳米（图2f），尺寸排阻色谱也证实了蛋白的成功修饰（图2g）。透射电镜、原子力显微镜和冷冻电镜观察均证实，pre-F蛋白修饰并未破坏ICO的三维二十面体结构，且多个蛋白簇成功附着于ICO表面（图2h–j）。
图2 | 展示多个RSV pre-F单体的DNA纳米载体疫苗的构建。
为系统评估ICO-RSV疫苗激活B细胞的效率，研究团队构建了稳定表达抗原特异性B细胞受体的Ramos B细胞系（B-AM14细胞），其中AM14抗体能够特异性识别pre-F蛋白的聚集体而非单体。研究首先在ICO的一个顶点处将五个pre-F单体排列为一个抗原簇，系统改变簇内抗原间距（从2.5纳米到40纳米）（图3a）。流式细胞术结合实验显示，抗原间距越小，疫苗与B-AM14细胞的结合亲和力越高，其中2.5纳米间距组具有最高的亲和力（图3b），并诱导最强的钙离子内流信号（图3c）。随后，团队将抗原簇数量从1个逐步增加到12个（图3d），发现结合亲和力及B细胞激活能力均随之增强（图3e、f），但6个簇和12个簇的效果相当，因此选择6个抗原簇进行后续实验。在确定6个抗原簇的基础上，团队再次优化抗原间距（图3g），确认2.5纳米为最优间距（图3h、i）。此外，均匀分布的抗原簇相比单侧分布能更有效地激活B细胞（图3j–l）。研究还证实，ICO-RSV-6c-2.5疫苗能够被识别pre-F不同表位区域（I、II、III、IV、V和θ位点）的B细胞有效识别，表明该疫苗保留了抗原的多表位暴露能力。综合上述结果，具有6个均匀分布抗原簇、簇内抗原间距2.5纳米的ICO-RSV-6c-2.5疫苗展现出最优的B细胞激活性能，被确定为优化的ICO-RSV疫苗。
图3 | ICO-RSV疫苗表面抗原排布与B细胞激活能力的构效关系。
在完成疫苗构建后，研究团队对优化的ICO-RSV疫苗在体内的分布和免疫应答进行了系统评估。Cy5荧光标记的ICO-RSV疫苗经鼻给药后，在鼻腔和肺部可持续检测到荧光信号长达7天，与空载体ICO的滞留特性相似（图4a–d）。与物理混合的ICO+RSV相比，ICO-RSV在鼻腔和肺部的积累显著更高（图4e、f），并且能被树突状细胞和巨噬细胞更高效地摄取（图4g、h）。在抗原呈递方面，ICO-RSV组在鼻腔、肺部和纵隔淋巴结中诱导的成熟树突状细胞和巨噬细胞比例显著高于对照组，且应答更为持久（图5a–c）。经两次鼻喷免疫后，ICO-RSV疫苗促进了明显的可诱导支气管相关淋巴组织（iBALT）形成，该三级淋巴器官在肺部特异性免疫应答中发挥关键作用（图5d）。此外，ICO-RSV组纵隔淋巴结中生发中心数量显著增多（图5e），RSV特异性生发中心B细胞、浆细胞和滤泡辅助T细胞的数量和持续时间均优于对照组（图5f–h）。这些结果表明，鼻喷ICO-RSV疫苗接种能有效诱导iBALT和生发中心应答，支持B/T细胞的增殖与成熟。
图4 | ICO-RSV疫苗经鼻给药后的生物分布。
图5 | 鼻喷ICO-RSV疫苗接种后小鼠体内抗原呈递和生发中心应答的追踪。
在免疫效果评估方面，BALB/c小鼠在第0天和第14天分别接受鼻喷免疫，以蛋白纳米载体RSV疫苗（I53-50）、ICO+RSV物理混合物为对照，并以临床获批mRNA-1345同款脂质纳米颗粒配制的pre-F三聚体mRNA疫苗为阳性对照（肌肉注射），每剂鼻喷纳米疫苗含5 μg RSV蛋白，mRNA疫苗每剂含1 μg mRNA（图6a）。第28天结果显示，所有四种疫苗均能诱导血清中针对pre-F单体或三聚体的IgG水平显著升高，但ICO-RSV组在鼻灌洗液和肺泡灌洗液中的IgG和IgA水平显著高于其他各组。尤为重要的是，肌肉注射的mRNA疫苗在呼吸道黏膜中未诱导出可观测的IgA，而蛋白纳米载体I53-50疫苗诱导的IgA水平也显著低于ICO-RSV。在中和抗体方面，ICO-RSV疫苗诱导的中和抗体滴度显著优于对照制剂（图6b）。在细胞免疫方面，鼻喷ICO-RSV在脾脏中诱导的RSV特异性T细胞应答显著强于肌肉注射的mRNA疫苗（图6c）。在第28天的分析中，ICO-RSV疫苗还能显著增加肺部组织驻留记忆T细胞（TRMs）的数量，这是呼吸道抵御病原体再次入侵的关键免疫记忆细胞。在C57BL/6小鼠中，虽然应答强度总体低于BALB/c小鼠（与C57BL/6偏向Th1的免疫遗传背景一致），但ICO-RSV仍诱导了显著增强的抗原特异性体液免疫应答，证明了该平台在不同遗传背景小鼠中的一致免疫原性。
研究团队进一步将ICO-RSV与两种具有临床相关性的鼻喷疫苗平台进行了头对头比较。与表面展示pre-F单体的脂质体疫苗（Liposome-RSV）相比，ICO-RSV在鼻腔和肺部的滞留密度更高，诱导的抗原特异性IgG和IgA显著更强。与编码pre-F三聚体F蛋白的腺病毒载体疫苗（AD-RSV）相比，ICO-RSV诱导的抗原特异性IgG显著更高，IgA水平差异无统计学意义。团队还验证了该DNA纳米平台递送其他呼吸道抗原（如流感血凝素蛋白和新冠病毒RBD结构域）的效果，ICO基疫苗均能产生显著升高的抗原特异性抗体滴度，证明了该平台的广谱适用性。
为评估免疫持久性，研究团队对免疫后长达28周的免疫应答进行了追踪（图6d）。结果显示，虽然两种疫苗在短期均能诱导高水平的血清pre-F特异性IgG，但mRNA组的IgG水平随时间下降更快，而ICO-RSV组下降更为平缓（图6e）。至第28周，mRNA组血清IgG水平显著低于ICO-RSV组（图6f）。在呼吸道黏膜中，mRNA疫苗诱导的IgG和IgA均极为有限，而ICO-RSV组在首次免疫后28周仍能检测到显著高于对照组的黏膜IgG和IgA水平（图6g–j）。在免疫记忆细胞分析中，ICO-RSV组小鼠脾脏中的中央记忆T细胞（Tcm）、效应记忆T细胞（Tem）、RSV特异性记忆B细胞以及IgG/IgA型长寿命浆细胞（LLPCs）均显著高于mRNA疫苗组（图6k–q），这可能是ICO-RSV组抗体水平持续高企的细胞学基础。生物安全性评估显示，鼻喷ICO-RSV未引起血液生化指标的显著改变，主要器官未见组织学异常，也未造成明显的呼吸功能异常。
图6 | 鼻喷ICO-RSV疫苗接种后小鼠体内的免疫学监测。
在RSV攻毒保护实验中，小鼠在第0天和第14天接受鼻喷免疫后，于第28天经呼吸道接种RSV病毒。研究团队还设计了一种均匀分布30个表面pre-F单体的ICO-RSV-UNI疫苗作为对照，以展示表面抗原排布设计的重要性。结果显示，ICO-RSV和ICO-RSV-UNI均能降低肺部病毒载量，但优化后的ICO-RSV疫苗表现出更优的清除效果。肺组织病理学检查显示，ICO-RSV组在攻毒后第31天和第42天的肺组织损伤均最轻。免疫组化分析进一步证实了ICO-RSV组肺部病毒载量的显著减少，同时该组肺部的CD8+ T细胞数量最多，表明局部细胞免疫激活最为强烈。在体液免疫方面，ICO-RSV疫苗诱导了最高水平的结合抗体和中和抗体。免疫记忆细胞分析也显示，ICO-RSV组的TRMs、Tcm、Tem和RSV特异性记忆B细胞及长寿命浆细胞均为最高。
综上所述，该研究通过构建具有不同几何特性的DNA纳米载体库，筛选出经鼻给药后具有最优呼吸道滞留特性的90纳米二十面体DNA纳米载体（ICO）。利用精准的“刻印-印刷”策略，研究团队在ICO表面以优化的空间排布方式偶联多个pre-F单体，构建了能够强效激活B细胞的鼻喷RSV疫苗。该疫苗实现了抗原在呼吸道深部的递送、持久的抗原滞留和高效的抗原呈递细胞加工处理。与临床mRNA疫苗相比，ICO-RSV疫苗能够诱导更持久、更强效的黏膜、体液和细胞免疫应答，在小鼠模型中提供了强有力的抗RSV感染保护。这项研究不仅提出了一个极具前景的鼻喷RSV疫苗候选方案，也为针对其他呼吸道病原体的疫苗开发建立了一个通用的DNA纳米载体平台。研究团队指出，当前工作中使用的是构象稳定的pre-F单体抗原而非天然三聚体刺突蛋白，虽然单体抗原排布便于明确解析抗原间距和簇数量对B细胞激活的调控机制，但未来将直接比较ICO表面展示的单体与三聚体抗原，以进一步厘清抗原天然构象与超分子空间排布对疫苗效力的各自贡献。
来源：BioMed科技
