合成工程细菌作为活体治疗手段，能够给精准感知病灶并定植于肿瘤、炎性组织等复杂环境，但其脱靶扩散及遗传控制策略在长期应用中的进化逃逸风险，构成了严峻的安全挑战。
可植入水凝胶通过物理封装克服传统哺乳动物细胞对缺氧环境的敏感缺陷，实现材料与活体载体的优势互补，但目前仍面临核心瓶颈：现有技术大多仅能实现短期限制，无法在体内长期植入中有效阻止细菌逃逸。因此，开发兼具长期稳固封装与动态响应能力的活体材料，是保障此类疗法安全落地的关键。
近日，美国哈佛大学的David J Mooney等人提出假设，满足材料的两个关键标准即可实现对治疗性细菌的稳健且持久的限制：（i）抵抗增殖细菌产生的内力；（ii）具备足够的机械韧性以承受周围组织的变形。此外，制造工艺需具有生物相容性以保持细菌活力。基于这些原则构建的可植入活体材料（ILMs）实现了体内稳定的微生物限制，从而支持疾病感知和自主治疗释放。这是一种具有双重力学特性的水凝胶支架：高刚度以调控细菌增殖，高韧性以抵抗生理应力下的材料断裂。该设计实现了长达6个月的完全细菌限制，并能承受多种形式的机械载荷，而这些载荷在其他情况下会导致材料灾难性失效。通过对嵌入细菌进行基因工程改造，作者团队赋予了该材料环境感知和按需治疗释放的能力，并在小鼠假体关节感染模型中验证了自主治疗效果。
ILMs的设计与力学表征：
细菌在受限条件下产生的增殖压力超过约300 kPa，比哺乳动物细胞通常产生的力高出约两个数量级。为评估刚性封装基质能否抵抗这种生物量膨胀，制备了刚度递增的生物相容性琼脂糖水凝胶，并利用延时显微镜追踪细菌生长。菌落扩张速率随基质刚度增加而降低，这表明存在一种机械反馈机制，即周围材料可调节细菌生长。尽管各菌株的基础生长速率不同，但所有菌株均表现出随基质刚度增加而扩张速率相似降低的趋势。选择大肠杆菌ClearColi（Ecc）用于后续研究——该菌株在临床前动物模型中已有成熟应用，免疫原性较低，且具有BL21遗传背景，经优化可高效生产治疗性蛋白。
为确定这种刚度-生长关系是否适用于不同材料平台，测试由不同聚合物类型、浓度和分子量组成的水凝胶文库。在所有测试体系中，更高的刚度均持续抑制了细菌扩张。其他力学性能，包括拉伸强度、断裂功和断裂应变，与刚度相比，与生长速率的关联性更弱且一致性更低。最后，测试了高刚度能否完全阻止Ecc生长。在琼脂糖和聚乙二醇基体系中，当基质刚度超过约1.5 MPa时，菌落扩张停止。在此模量下，细菌可能无法使周围基质变形，从而确立了在ILMs中限制细菌增殖所需的刚度阈值。
人体组织持续处于运动之中，由此产生的机械应力可损伤植入材料。因此，ILMs除需具备刚性外，还必须具有高韧性，以防止材料断裂和细菌大量逃逸。然而，根据Lake-Thomas理论，增加材料刚度往往导致脆性增大。尽管已有多种水凝胶被设计用于克服这一权衡，但许多水凝胶依赖于与活细菌不兼容的组分和制备方法。先前报道的封装治疗性大肠杆菌的水凝胶未能同时获得足够的刚度和断裂韧性。作为解剖学应力的基准，采用已报道的柔软胶原组织的断裂功，约为0.5 MJ/m³。
为开发兼具刚性和高韧性的ILMs，转向了一类通过致密结晶域交联的水凝胶。这种结晶域结构通过充当刚性颗粒提供高刚度，同时分散应力以抵抗裂纹扩展。选择PVA作为基础聚合物，因其低毒性、化学稳定性和已确立的临床应用。通过多种组合产出了弹性模量约为3 MPa、断裂功超过20 MJ/m³的水凝胶，超越了抵抗细菌扩张和承受组织级机械应力所需的阈值。为更直接地评估韧性，利用纯剪切测试测量了PVA和具有匹配刚度的琼脂糖水凝胶的断裂韧性。所得PVA水凝胶的断裂韧性超过5 kJ/m²，比脆性琼脂糖高出一个数量级。由于植入材料承受反复载荷，还利用循环裂纹扩展测试评估了抗疲劳性。增韧PVA表现出约450 J/m²的高疲劳阈值，比琼脂糖提高了10倍以上。PVA的其他力学性能，包括断裂应变和拉伸强度，也比琼脂糖至少高出一个数量级。基于X射线散射测量，PVA水凝胶的平均晶区间距计算为13.5 nm。力学和溶胀分析得出的交联点间摩尔质量约为10³ g/mol，表明这是一个紧密交联的网络。
图：ILMs的设计与力学表征
ILMs实现长期细菌限制并抵抗机械应力：
接下来，试图通过将细菌整合到工程化PVA基质中来建立ILMs。理想的ILM应包含内部空隙以支持细菌生长和活性。然而，引入此类力学薄弱区域可能损害支架的整体完整性。为平衡这些相互竞争的需求，计算出本体PVA的断裂内聚长度约为400 μm，定义为断裂韧性与单位体积断裂功之比。该长度估算了材料在不牺牲力学性能的情况下所能承受的最大缺陷尺寸。基于此阈值，制备了微凝胶，将Ecc引入PVA内的微尺度空隙中。具体而言，利用水包油乳液生成含Ecc的微凝胶，并过滤去除超过尺寸限制的颗粒。选择明胶作为微凝胶材料，因其能够保护Ecc免受脱水损伤，且可在生理温度下发生热可逆凝胶化。为确定允许的微凝胶负载量，改变了掺入PVA基质中的微凝胶体积分数。力学测试表明，当微凝胶分数低于约20%时，本体材料性能得以保持，可能接近渗流阈值。
测试ILMs能否有效防止细菌逃逸。对浸没在培养基中的ILMs进行延时显微镜观察，显示Ecc最初在微凝胶空隙内复制，证实细菌活力在ILM制备过程中得以保持。然而，随着菌落扩张，生长在到达微凝胶与周围PVA基质的界面时停滞，未观察到对本体支架的侵入。菌落形成单位计数和活死染色证实，在初始生长阶段后，细菌群体保持稳定，活力超过97%。为评估长期限制效果，ILMs被连续培养长达6个月。对周围培养基的间歇性采样显示，在此期间未检测到细菌逃逸。与此同时，PVA支架内的细菌在整个培养期间均保持活力。封装的Ecc在无抗生素选择的1周培养中保留了所有质粒，随后质粒丢失的速率显著低于非封装细菌的报道速率。PVA支架还有效限制了其他大肠杆菌菌株，包括Nissle 1917和MG1655，同时在延长培养中保持其活力。
为评估力学稳健性，ILMs承受了一系列应力并检测细菌泄漏情况。以具有匹配刚度的琼脂糖水凝胶作为对照。在模拟压缩和拉伸载荷条件下，ILMs未释放可检测的Ecc，而琼脂糖则发生断裂并允许细菌逃逸。加载后活力检测证实，Ecc在承受机械应力后仍存活于完整的ILMs中。还通过在拉伸加载前在支架中引入缺口来模拟潜在的材料缺陷或损伤。在约<150 kPa的低应力水平下，裂纹扩展并使细菌从琼脂糖中释放，而ILMs即使在约500 kPa下仍能抵抗裂纹扩展并防止逃逸。为模拟长期暴露于生理应变的情况，ILMs还承受了模拟反复生理应力的循环拉伸加载。经过10,000次加载循环后，支架保持完整并继续限制有活力的Ecc。ILMs在3周孵育后也保持了力学性能。
图：ILMs在长期培养和机械加载过程中维持细菌限制
ILMs自主感知环境并释放治疗药物：
ILMs的一个前景广阔的应用是作为局部药物储库。尽管可植入材料被广泛用于局部治疗性递送，但传统设计在剂量动态、可持续性和感知能力方面存在局限。ILMs有望通过对嵌入细菌进行基因工程改造以感知疾病并按需生产药物，从而克服这些限制。作为概念验证应用，聚焦于假体周围植入物感染，这类感染往往难以诊断，若能早期干预则可降低菌群失调和抗生素耐药的风险。铜绿假单胞菌感染尤其棘手，因其与植入物表面具有牢固的关联性，且对多种常见抗生素具有固有耐药性。尽管进行了额外手术、清创和静脉抗生素疗程，治疗失败率仍高达约75%。
设计一种遗传回路，使Ecc能够自主感知铜绿假单胞菌并通过Ecc自裂解实现按需治疗释放。将"自主"定义为ILMs感知并响应环境信号的能力。具体而言，在Ecc中构建了一个群体感应系统，将N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）敏感的luxB启动子与自裂解E基因的表达相偶联。在该系统中，激活后可实现治疗药物的脉冲式释放，而随机裂解释放则使微生物能够再生以供后续激活。为评估感知性能，将携带绿色荧光蛋白（GFP）偶联回路电路的Ecc暴露于铜绿假单胞菌的纯化AHL中。群体感应诱导后GFP表达升高，检测限处于纳摩尔范围。接下来，将E基因克隆至传感器下游，使Ecc在暴露于纯化AHL和铜绿假单胞菌条件培养基时发生裂解，释放GFP载荷。为实现抗菌活性，构建了一个治疗盒，在强组成型启动子下表达一种合成抗铜绿假单胞菌蛋白（ChPy）。ChPy可绕过某些铜绿假单胞菌菌株中的天然耐药性，但也会在Ecc中诱导自体毒性。为减轻此效应，串联共表达了多个免疫基因，使ChPy得以稳定生产。为评估治疗效果，将工程化Ecc的超声裂解产物施加于铜绿假单胞菌培养物中，结果病原菌活力降低。最后，将传感器和治疗模块整合到单一菌株中，实现了对多种铜绿假单胞菌菌株的自主AHL触发治疗。
将治疗性Ecc掺入PVA支架中，并利用延时显微镜追踪裂解回路的感知-响应行为。添加AHL后，荧光信号上升并迅速消散，与群体激活后通过程序性裂解导致群体崩溃的结果一致。为评估活体材料的长期活性，在培养1周、3个月和6个月后测量了回路激活情况，发现ILMs保留了感知功能，表明嵌入的遗传系统具有持久的性能。为评估ILMs的治疗释放能力，接下来测量了不同尺寸的异硫氰酸荧光素-葡聚糖分子的扩散。基质的扩散截留分子量约为250 kDa，表明包括ChPy在内的许多大分子蛋白载荷可在数天内释放。利用不同分子量的蛋白载荷验证了生物大分子的释放和功能活性。与这些测量结果一致，诱导嵌入Ecc裂解可导致ILM内部检测到蛋白释放。在无诱导条件下，ILMs表现出低基线载荷释放和超过97%的细菌活力。当短暂诱导2小时后，蛋白释放主要发生在前8小时内，随后释放速率降低。反复刺激导致多轮蛋白释放，伴随细菌群体的相应减少。当与铜绿假单胞菌共培养时，ILMs抑制了病原菌生长，展示了通过自主感知、裂解和抗菌释放实现的闭环感染治疗。为评估平台在抗菌治疗之外的通用性，在癌症相关场景中测试了ILMs。与GFP对照组相比，封装了经工程化表达可诱导孔道形成毒素的Ecc的ILMs的条件培养基显著降低了CT26癌细胞的活力。
图：ILMs通过工程化遗传回路检测病原信号并释放治疗载荷。
ILMs体内治疗植入物相关感染：
在体内评估了ILMs治疗假体周围关节感染的效果。该模型旨在模拟植入后早期感染，而临床上大多数感染正发生在这一阶段。建立了小鼠模型，将不锈钢假体植入股骨髓腔，并将ILMs系附于植入物远端，使其定位于关节腔内。为评估细菌限制效果，检测了植入后Ecc向周围组织的扩散情况。植入1天后，ILM附近组织中未检测到Ecc，而在无PVA支架的情况下则发生了细菌逃逸。接下来，评估了长期安全性和稳定性。在一周内，小鼠体重逐渐恢复，与典型的术后恢复一致。在植入后第1、3和7天，假体周围组织、假体装置、肝脏或脾脏中均未检测到Ecc。尽管实现了有效的生物限制，ILMs仍支持封装Ecc生长至饱和并在体内维持其活力。为检验工程化遗传回路在植入后是否仍保持功能，从取出的ILMs中分离了携带群体感应质粒的Ecc。在体内7天且无抗生素选择的条件下，绝大多数回收菌落仍保留了工程化质粒。经AHL诱导后，所有检测的超过100个分离株均显示出强GFP表达，证实传感器功能在体内得以保留。还通过定量ILMs对外源诱导剂给药和铜绿假单胞菌感染的响应，进一步在体内验证了自主感知功能。为评估ILM植入引起的免疫反应，对植入物周围组织和血清进行了多重细胞因子谱分析。植入后第1天，与缺乏PVA支架的含Ecc微凝胶相比，ILM处理组小鼠的局部炎症信号降低。至第7天，与空白PVA对照组相比，局部或全身细胞因子水平未检测到实质性差异。与这些发现一致，植入后2周的植入物周围组织学分析显示ILMs保持完整，伴有轻度炎症和局限性纤维化，这是手术植入金属钉和水凝胶的典型表现。
最后，通过用铜绿假单胞菌感染假体装置来测试ILMs的疗效。以GFP作为治疗释放的代理指标，在植入物周围组织中检测到可测量的载荷累积。疗效在感染后第3天进行评估，此时对应于该模型中病原菌负荷的峰值。为追踪病原菌在关节腔内的定植情况，使用了生物发光铜绿假单胞菌Xen41。在缺乏ChPy的ILMs处理组中，发光信号在3天内持续上升，表明感染未得到控制。相比之下，含有治疗性Ecc的ILMs抑制了铜绿假单胞菌的生长，表现为信号累积速度减缓。为研究ILMs对未改造的临床相关病原菌的疗效，接下来用从患者伤口分离的铜绿假单胞菌ATCC 15692菌株感染小鼠。感染后第3天，对小鼠实施安乐死并量化植入部位的活铜绿假单胞菌水平。与对照组相比，治疗性ILMs显著降低了病原菌负荷，证明了该系统自主感知并治疗假体周围感染的能力。
图：ILMs在小鼠关节植入物模型中限制工程化细菌并治疗感染
小结：
作者团队提出了一种ILM平台，能够在体内实现治疗性细菌的稳健限制和长期存活。通过将水凝胶力学性能工程化至超过临界刚度和韧性阈值，ILMs在保持细菌功能的同时防止细菌过度增殖和材料断裂。制备工艺与活体微生物兼容，对封装细菌的基因编程使其具备自主感知-响应行为，从而实现按需响应环境信号的治疗释放。
基于材料的物理限制提供了与遗传控制策略互补的优势。与遗传减毒或可控灭活不同，物理限制不依赖于在持续进化压力下维持遗传保真度，且ILM架构引入了空间区室化，限制了群体混合和罕见逃逸事件的传播。材料进一步施加了尺寸选择性限制机制，在保留细菌的同时释放治疗性蛋白载荷。尽管经过封装，ILMs实现了与已报道的体内细菌疗法相当的单细胞蛋白生产力。
先前研究表明，治疗性细菌可在体内持续数月，表明ILMs具有长期植入的潜力。在此时间尺度上，物理限制可与遗传减毒和外部抗生素清除相结合，提供分层、正交的安全保障。值得注意的是，工程化细菌仍对抗生素治疗敏感，这使得微生物活性可被可控终止。尽管免疫谱分析未显示病理性炎症的证据，但将评估扩展至更长的体内持续时间和与人类相关的免疫环境对于临床转化同样重要。
ILMs有别于其他治疗模态，如载药储库和疫苗。通过直接感知病原体来源的信号并局部释放抗菌载荷，ILMs可在植入部位实现快速、非抗原依赖性的干预。这种局部化、自主化的作用方式非常适合假体周围关节感染，因为早期干预至关重要。体内观察到的疗效幅度可能反映了载荷选择、蛋白生产、通过PVA支架的扩散以及治疗性细菌与入侵病原菌之间空间关系的综合作用。
更广泛地说，抗菌和抗癌载荷递送的双重验证凸显了ILMs作为通用化平台用于局部化、响应性治疗的潜力，包括局部植入和器械涂层等应用。综上所述，这些结果确立了ILMs作为在多种疾病场景中部署微生物药物作为自主治疗储库的基础。
参考文献
Tetsuhiro Harimoto, Fernando Herrero Quevedo, Janis Zillig, et al. Implantable living materials autonomously deliver therapeutics using contained engineered bacteria. Science. 2026 May 14;392(6799):729-734.
https://www.science.org/doi/10.1126/science.aec2071
来源：奇物论
