抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）和小分子-药物偶联物（small-molecule-drug conjugate，SMDC）通过“靶向配体—连接子—效应载荷”的模块化结构，将高活性药物定向输送至肿瘤组织。ADC已成为肿瘤精准治疗的重要技术路线，小分子偶联物则具有结构明确、组织穿透较快和制造相对简化等特点。两类体系的共同目标，是在提高肿瘤暴露的同时降低游离毒性载荷对正常组织的损伤。

然而，绝大多数经典偶联药物遵循“内吞后释放”（internalization-to-release，ITR）模式：配体与细胞膜受体结合后，偶联物需经受体介导内吞进入内体与溶酶体，再通过蛋白酶切割、酸敏裂解或抗体降解释放药物。该过程对靶点内吞效率、细胞内运输和连接子裂解均有依赖，任一环节效率不足都会限制有效载荷释放。在人类超过2,000种膜蛋白中，仅约180种具备较高内吞能力，即可支持传统ITR开发的靶点约占10%；多数肿瘤相关膜蛋白仍因内吞不足而难以转化为偶联药物靶点。

这一限制使ADC研发集中于HER2、TROP2等少数成熟靶点，并增加同质化竞争。即使偶联物成功内吞，多步骤溶酶体转运也会造成效率损失，最终只有部分进入细胞的偶联物能够释放载荷。近年来已有研究提出胞外蛋白酶裂解、肿瘤微环境响应及双组分“点击释放”等非内吞方案，但这些路线可能依赖酶表达、微环境差异或额外触发剂，仍存在选择性和操作复杂度问题。

成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）体现了这一矛盾。FAP广泛高表达于多种肿瘤的癌相关成纤维细胞，在正常组织中表达相对有限；FAPI放射性示踪剂已可对28种以上肿瘤进行成像，证明其泛癌靶向价值。但FAP内吞效率较低，限制了传统FAP靶向偶联药物的疗效。临床候选药物OMTX705的最佳结果主要为疾病稳定，进一步显示仅有结合能力并不足以保证ITR模式下的充分载荷释放。

配体导向化学提供了另一种可能：配体结合靶蛋白后，可将反应基团定位到结合口袋邻近的特定氨基酸残基旁，通过空间邻近效应加速共价反应。作者据此提出“结合即释放”（binding-to-release，BTR）策略。偶联物在循环中保持稳定；与靶蛋白结合后，连接子上的亲电中心靠近结合口袋内亲核残基，并被直接进攻，由此在细胞外释放可透膜载荷。BTR将药物释放与受体内吞解耦，使“能否释放”由靶点的内吞性质转变为配体结合构象、邻近残基和连接子反应性的共同结果。

成果简介

为实现这一机制，北京大学刘志博等人开发了五价磷-酚交换反应（phosphorus(V)-phenol exchange，PhoPEx）。该化学受到六价硫氟交换（SuFEx）启发，以五价磷作为亲电中心，并与含自毁型对羟基苄醇结构的离去基团结合。研究以低内吞FAP为主要模型，系统分析反应动力学、关键残基、临床标本识别、药代分布与抗肿瘤治疗窗；同时将策略扩展至PD-L1和mRNA展示筛选获得的FAP环肽，以评估平台化潜力。

研究建立了PhoPEx介导的BTR药物释放体系。FAPI靶向头与FAP结合后，PhoPEx亲电中心被定位于Tyr745邻近区域，随后发生近距离诱导反应并释放荧光分子、MMAE或exatecan等载荷。串联质谱、定点突变、冷冻电镜和分子动力学分析共同支持Tyr745为主要反应位点；Y745F突变使载荷释放率降低63%。

优化后的间位氟取代PhoPEx兼具较高反应性和水解稳定性，反应半衰期缩短至3.5 h。FAP-BTR-SMDC在肿瘤中的MMAE暴露量较FAP-ITR-SMDC提高5.9倍，并达到FAP-ITR-ADC的相近水平；其肿瘤/血液比和肿瘤/肝脏比分别达到39.7和358.1。与FAP-ITR-SMDC相比，两项比值分别提高14.7倍和55.1倍；与FAP-ITR-ADC相比，分别提高3.6倍和58.7倍。

改善的组织分布转化为更宽的安全窗口。FAP-BTR-SMDC的最大耐受摩尔剂量为FAP-ITR-SMDC的7.5倍；在细胞来源移植瘤中，单次6.2 mg kg⁻¹给药使8/8只小鼠在30天内达到完全缓解，并保持体重稳定和100%生存。多个患者来源移植瘤模型亦显示出显著抑瘤效果。

该策略还被用于FAP响应型荧光探针、mRNA展示来源环肽-药物偶联物以及PD-L1靶向SMDC，显示其可适配不同配体、靶点与载荷。需要注意的是，当前治疗证据主要来自小鼠模型；BTR依赖可透膜载荷，且胞外释放可能带来旁观者效应与离靶扩散风险，其人体药代、安全性和长期毒性仍需进一步评价。

PhoPEx实现“结合即释放”

作者首先尝试将SuFEx与自毁型酚结构结合，构建硫-酚交换（SuPEx）体系，但该结构即使采用对硝基苯酚作为离去基团，对酪氨酸的反应性仍很低。随后，中心亲电原子由硫替换为磷，形成PhoPEx反应，并采用对羟基苄醇作为离去结构。分子对接显示，FAPI进入FAP结合口袋后，周围存在可接近的亲核残基，为邻近诱导裂解提供了空间基础。

与FAP蛋白共同孵育24 h后，装载香豆素或MeRho的FAPI-PhoPEx偶联物出现明显荧光释放；SuPEx偶联物和PBS对照未见相同反应。HT1080-FAP细胞中荧光被选择性激活，而FAP阴性HT1080细胞信号有限。装载MMAE的BTR偶联物可杀伤FAP阳性细胞，装载膜通透性较低MMAF的偶联物则无明显作用；相反，采用Val-Cit连接子的ITR体系对两种载荷均可产生作用。MMAE与MMAF之间的差异支持载荷在细胞外释放后再扩散入胞，而非依赖偶联物内吞。该机制也界定了BTR对载荷膜通透性的基本要求。

第一代PhoPEx已能在FAP结合后释放载荷，但反应速率与小分子偶联物较短的循环半衰期并不完全匹配。研究据此合成15种PhoPEx结构，通过取代基电子效应调控反应性和水解稳定性。以SuFEx为参照，间位氟和对位酰胺取代结构表现较优：其二级反应速率常数分别为3.92×10⁻³和4.35×10⁻³ M⁻¹ s⁻¹，与SuFEx的3.99×10⁻³ M⁻¹ s⁻¹相当；水解速率常数则低于SuFEx。

间位氟取代将反应半衰期缩短至3.5 h，同时大体保持水解稳定性。PET-CT显示，间位氟PhoPEx-FAPI的肿瘤SUVmax与SUVmean约为未取代结构的2倍；对位酰胺结构则可与FAP快速形成不可逆共价结合，并较非共价FAPI04获得更高肿瘤摄取与滞留。这些结果表明，PhoPEx可通过结构调控在循环稳定性与结合后反应效率之间建立平衡。

图|PhoPEx化学实现不依赖内吞的“结合即释放”靶向药物递送策略

BTR由邻近残基介导

为排除FAP本身酶活性造成非特异裂解的可能，研究利用串联质谱、定点突变、冷冻电镜和分子动力学模拟解析反应位点。质谱显示，Tyr745是FAP与PhoPEx探针孵育后的主要修饰残基，同一α螺旋上的His743和Thr741可作为次要位点。

当Tyr745突变为苯丙氨酸时，偶联物与FAP的共价结合效率下降，行为更接近可逆抑制剂FAPI04；与野生型FAP相比，Y745F突变体触发的载荷释放率降低63%。冷冻电镜显示FAPI靶向头位于FAP结合位点，DOTA和MMAE部分因构象灵活而未形成清晰密度。结合分子动力学模拟，PhoPEx反应性磷中心被确认处于Tyr745的空间邻近位置。多种证据共同表明，释放主要由配体结合建立的几何邻近关系驱动，而非单纯依赖FAP催化活性或连接子自发水解。

图|Tyr745空间邻近介导结合诱导的PhoPEx载荷释放

BTR具有靶点特异性和较高释放效率

研究首先构建了FAP响应型荧光探针FAPI-P-Cy5-QSY21。探针与FAP结合后，淬灭基团QSY21被释放，Cy5荧光恢复。该探针在纯化蛋白、细胞和小鼠模型中均显示FAP依赖的荧光增强。进一步在髓样甲状腺癌患者切除淋巴结中进行验证：直径通常小于5 mm的淋巴结被二分并破坏包膜，以2 μM探针在37 ℃孵育40 min后用PBS洗涤3次。FAP免疫组化显示，高荧光淋巴结多为FAP阳性，低荧光淋巴结多为FAP阴性；FAP阳性样本的平均辐射效率为阴性样本的2.9倍。该实验支持BTR化学在临床标本中的靶点依赖性，但尚不等同于前瞻性诊断准确性研究。

在分子层面，FAP-BTR-SMDC对FAP的结合选择性较DPPIV和PREP等同源蛋白高1,000倍以上。即使存在100倍当量亲核氨基酸、10倍当量白蛋白或碱性磷酸酶，或置于人血清中，只有加入FAP后才出现快速载荷释放。该体系可释放荧光分子、微管抑制剂MMAE及拓扑异构酶I抑制剂exatecan，说明载荷兼容性并非局限于单一结构。

FAP阳性U87MG-FAP细胞与阴性U87MG-Vector细胞对FAP-BTR-SMDC的IC₅₀分别为9.0 nM和498.9 nM。相同孵育条件和时间点下，PhoPEx-BTR荧光释放信号为Val-Cit-ITR连接子的8倍以上。静脉注射后24 h，HT1080-FAP肿瘤中的MMAE浓度为FAP阴性HT1080肿瘤的34.5倍；0-120 h肿瘤MMAE暴露量较FAP-ITR-SMDC提高5.9倍，并与FAP-ITR-ADC相近。

FAP-BTR-SMDC的肿瘤/血液和肿瘤/肝脏比达到39.7与358.1，显著高于两类ITR对照。数据表明，BTR小分子偶联物既提高靶区载荷释放，又降低血液和肝脏中的非特异释放；不过不同平台的分子量、药代和给药剂量存在差异，跨SMDC与ADC比较应结合等摩尔载荷设计理解。

图|BTR策略通过特异性释放实现高效药物递送

BTR拓宽治疗窗

急性毒性研究以体重下降不超过20%为最大耐受剂量判定标准。FAP-BTR-SMDC的最大耐受摩尔剂量为FAP-ITR-SMDC的7.5倍，提示更高靶点特异性和较低系统性释放能够转化为安全窗口扩展。在细胞来源HT1080-FAP移植瘤中，等剂量下BTR偶联物的抑瘤效果优于ITR-SMDC；单次静脉注射6.2 mg kg⁻¹ FAP-BTR-SMDC后，8/8只小鼠在30天内达到完全缓解，体重保持稳定且观察期生存率为100%。该“完全缓解”结果来自特定小鼠移植瘤和给药条件，不应直接外推为临床治愈率。

在FAP直接表达于肿瘤细胞的肉瘤患者来源移植瘤中，6.2 mg kg⁻¹ FAP-BTR-SMDC（约为其最大耐受剂量的15%）优于FAP-ITR-SMDC，疗效略高于22.2 mg kg⁻¹ FAP-ITR-ADC（约为其最大耐受剂量的50%）。在FAP主要表达于癌相关成纤维细胞的胰腺腺鳞癌模型中，大分子ADC受致密间质穿透限制，BTR-SMDC表现出更强抑瘤作用；终点肿瘤重量分别为0.19±0.07 g和1.32±0.41 g。

BTR偶联物还在MC38-FAP细胞来源移植瘤、下咽癌及壶腹周围癌患者来源模型中表现出抗肿瘤活性，且疗效与FAP表达水平相关。这些结果从最大耐受剂量和多模型疗效两方面支持治疗窗扩大，同时也提示患者选择可能依赖靶点表达、肿瘤间质构成和载荷敏感性。

为探索配体来源的扩展，作者将mRNA展示获得的含SuFEx非天然氨基酸FAP环肽改造为PhoPEx释放型肽-药物偶联物。不同连接臂长度中，4个碳原子连接臂的释放速率最高，速率常数为3.25 h⁻¹，可在1 h内完成荧光载荷释放。该结果为利用超大规模mRNA展示文库直接筛选BTR肽配体提供了概念依据。

图|BTR药物递送系统在FAP阳性细胞来源及患者来源移植瘤模型中改善治疗特征

BTR可用于PD-L1靶向药物递送

作者对PDBbind v2020.R1数据库中的19,037个配体-蛋白共晶结构进行生物信息学分析，其中17,967个结构（94.4%）在配体10 Å范围内至少含有一个酪氨酸残基，说明可供PhoPEx利用的邻近化学环境可能较为普遍。随后，内吞效率较低且具有临床重要性的PD-L1被选为第二个靶点。

基于已报道的PD-L1环肽配体，PhoPEx被分别置换到Gly或Leu位置。Gly位点改造使亲和力降至0.54±0.11 μM，而Leu位点改造仍保持8.4±2.2 nM的高亲和力。高亲和Leu变体能够在体外释放香豆素、MeRho和MMAE。这一结果说明，BTR设计必须同时满足反应基团与亲核残基的空间接近以及配体亲和力保持，不能仅凭附近存在酪氨酸预测成功。

在表达PD-L1的HT1080肿瘤模型中，PD-L1-BTR-SMDC产生的肿瘤特异MMAE释放高于PD-L1-ITR-SMDC，并可被竞争性肽BMS-986189阻断，支持释放依赖受体结合。胃腺癌患者来源移植瘤中，PD-L1-BTR-SMDC亦表现出更好的抗肿瘤效果。从FAP扩展至PD-L1以及从小分子FAPI扩展至环肽，证明BTR并非仅适用于单一靶点或配体；但目前跨靶点验证数量仍有限，真正的平台普适性需要更大规模的结构与体内验证。

图|将BTR系统拓展至其他具有临床重要性的治疗靶点

小结

本研究提出了与传统ITR互补的BTR范式。ITR适用于HER2、TROP2等高效内吞靶点；BTR则面向大量低内吞膜蛋白，通过“稳定循环—靶点结合—邻近残基反应—胞外载荷释放”完成递送。PhoPEx连接子将配体结合构象、Tyr等亲核残基的位置和自毁型离去结构耦合，使载荷释放不再依赖内体-溶酶体运输。该策略的核心创新不是单纯提高连接子裂解速度，而是把靶点结合本身转化为释放触发事件。

FAP体系形成了较完整的证据链：结构优化提高反应效率，Tyr745被确定为主要邻近反应位点；临床淋巴结标本支持靶点依赖的荧光激活；药代研究显示更高肿瘤载荷暴露和更低正常组织释放；多种移植瘤模型进一步显示治疗窗扩大。PD-L1和mRNA展示环肽验证则初步拓展了靶点与配体范围。

BTR仍具有明确限制。首先，胞外释放要求载荷具备足够膜通透性，MMAF等低通透载荷不适用。其次，释放后的药物可产生旁观者效应，有利于杀伤抗原阴性邻近细胞，但也可能从肿瘤扩散至正常组织。再次，反应能否发生取决于结合位点几何结构、亲核残基可及性、连接子取向、靶点丰度及体内停留时间；数据库中存在邻近Tyr并不代表一定能够实现高效释放。

此外，现有疗效、安全性和组织分布数据以动物模型为主，临床标本实验主要用于荧光识别而非治疗。未来需系统评价不同载荷的扩散半径、血液学与神经毒性、免疫原性、人体药代及剂量分割策略，并建立可预测PhoPEx反应位点的结构筛选标准。因此，BTR目前应被视为突破低内吞靶点限制的临床前化学递送框架，而不是对ITR或现有ADC的全面替代。

参考文献

Wen, Z., Xu, M., Yan, Z. et al. A binding-to-release strategy for targeted anticancer drug delivery. Nature (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10971-0 

 

来源：纳米人